Cytokeratin 14 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400362-ACT

KRT14 kodiert Zytokeratin 14, ein Intermediärfilamentprotein vom Typ I, das mit Keratin 5 Heterodimere bildet und so das basale Keratinnetzwerk in mehrschichtigen Epithelien aufbaut. Dieses zytoskelettale Gerüst verleiht mechanische Widerstandsfähigkeit, unterstützt Zell-Zell-Adhäsion und epitheliale Differenzierung und ist mit Signalplattformen wie Integrin-/Hemidesmosomen-Komplexen sowie zytoskelettgesteuerten Stressantworten verknüpft. Eine veränderte KRT14-Expression oder -Funktion wird mit Phänotypen epidermaler Fragilität und gestörter Keratinisierung in Verbindung gebracht und KRT14 wird häufig als Marker basaler epithelialer Zustände in Haut- und Drüsengeweben verwendet. In der Krebsbiologie und in Modellen des Gewebeumbaus werden KRT14-assoziierte Programme im Zusammenhang mit epithelialer Plastizität, invasionsassoziierten Phänotypen und der Anpassung an mikroumgebungsbedingten Stress untersucht.

Cytokeratin 14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KRT14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Cytokeratin 14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KRT14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KRT14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Cytokeratin 14-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KRT14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Cytokeratin 14-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Cytokeratin 14-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KRT14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.