Cystinosin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405040-ACT

CTNS codifica a cistinosina, um transportador de membrana lisossomal que medeia o efluxo de cistina do lúmen do lisossomo para o citosol, contribuindo para o equilíbrio redox intracelular e a homeostase de aminoácidos. Ao regular a depuração de cistina nos lisossomos, a cistinosina conecta a função lisossomal a processos metabólicos mais amplos, incluindo a dinâmica do eixo autofagia–lisossomo e as respostas celulares ao estresse. Alterações na atividade de CTNS desorganizam o armazenamento lisossomal e as vias subsequentes de proteostase, tornando-o um ponto central para o estudo do controle de qualidade de organelas e da adaptação metabólica. CTNS está implicado na disfunção lisossomal associada à cistinose e é frequentemente investigado em modelos de fisiologia do túbulo proximal renal e de transporte sistêmico de aminoácidos.

Cystinosin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CTNS sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cystinosin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CTNS em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CTNS, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cystinosin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CTNS nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cystinosin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cystinosin em células tumorais com expressão de CTNS silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.