Plásmido CRISPR de Activación (h) cyclin D2: sc-401236-ACT

CCND2 codifica la ciclina D2, una ciclina central de la fase G1 que se une y activa a CDK4/6 para promover la fosforilación de las proteínas RB y la liberación de programas transcripcionales dependientes de E2F necesarios para la entrada en fase S. Mediante la integración de señales mitogénicas de vías como PI3K–AKT, MAPK/ERK y redes transcripcionales sensibles a factores de crecimiento, la ciclina D2 contribuye a regular la proliferación, el compromiso con el ciclo celular y la expansión específica de linaje en múltiples tejidos. La expresión desregulada de CCND2 o las alteraciones en su número de copias pueden perturbar el control de los puntos de control y las decisiones sobre el destino celular, lo que la hace relevante para estudios de remodelación oncogénica del ciclo celular, fenotipos de sobrecrecimiento del desarrollo y defectos de diferenciación dependientes del contexto. Dado que la ciclina D2 se integra con la actividad de CDK4/6 y la señalización RB–E2F, se utiliza con frecuencia como un nodo mecanístico para investigar la transcripción dependiente de la proliferación y la reprogramación metabólica.

cyclin D2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CCND2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

cyclin D2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CCND2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CCND2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de cyclin D2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CCND2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de cyclin D2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía cyclin D2 en células tumorales con expresión de CCND2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.