cyclin B2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402434-ACT

CCNB2 codifica la ciclina B2, una subunità regolatoria fondamentale del complesso CDK1 che promuove la transizione G2/M e la progressione mitotica. La ciclina B2 contribuisce all’attivazione tempestiva dei programmi di ingresso in mitosi, al coordinamento della dinamica dei centrosomi e alla fedeltà della segregazione cromosomica tramite il controllo dei checkpoint del ciclo cellulare. La sua espressione è strettamente regolata dalla proteolisi dipendente dall’ubiquitina mediata da APC/C, per garantire una corretta uscita dalla mitosi. Un’attività o un’espressione deregolata di CCNB2 è spesso associata a fenotipi proliferativi e a instabilità del ciclo cellulare, rendendola rilevante per gli studi sulla segnalazione oncogenica e sul mantenimento del genoma.

cyclin B2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCNB2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

cyclin B2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCNB2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCNB2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di cyclin B2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCNB2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da cyclin B2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via cyclin B2 nelle cellule tumorali con espressione di CCNB2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.