CrkRS CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402238-ACT

Humanes CDK12 kodiert eine cyclinabhängige Kinase, die mit Cyclin K zusammenwirkt, um die CTD der RNA‑Polymerase II zu phosphorylieren, und dadurch die Transkriptionselongation mit der kotranskriptionellen RNA‑Prozessierung koordiniert. CDK12 ist besonders wichtig, um die Expression langer, komplexer Gene aufrechtzuerhalten, die an der DNA‑Schadensantwort, der Toleranz gegenüber Replikationsstress und der Aufrechterhaltung der Genomstabilität beteiligt sind, und ist damit mit Netzwerken der homologen Rekombination und der Checkpoint‑Signalübertragung verknüpft. Eine Störung der CDK12‑Funktion verändert Transkriptionsprogramme, die den Zellzyklusfortschritt und die Wahl des Reparaturwegs steuern, mit nachgeschalteten Auswirkungen auf die chromosomale Integrität und die zelluläre Fitness. In der biomedizinischen Forschung wird CDK12 häufig im Kontext einer dysregulierten Kopplung von Transkription und Reparatur sowie seiner Assoziation mit Genominstabilitäts‑Phänotypen untersucht, die in mehreren Krankheitsmodellen beobachtet werden.

CrkRS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CDK12-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CrkRS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CDK12-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CDK12-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CrkRS-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CDK12-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CrkRS-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CrkRS-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CDK12-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.