creatine kinase-B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401868-ACT

Das humane CKB-Gen codiert für Kreatinkinase B, eine zytosolische Phosphotransferase, die die reversible Übertragung von Phosphat zwischen ATP und Kreatin katalysiert und dabei Phosphokreatin bildet. Dadurch wird eine schnelle ATP-Pufferung in Zellen mit schwankendem Energiebedarf unterstützt. Indem Kreatinkinase B die Produkte von Glykolyse und oxidativer Phosphorylierung mit einer lokalisierten ATP-Regeneration koppelt, trägt sie zur zellulären Bioenergetik, zum Ionentransport und zur Zytoskelettdynamik bei, insbesondere in neuronalen und anderen erregbaren Geweben. Veränderungen der CKB-Expression und der Kreatinkinase-Aktivität wurden mit metabolischen Stressantworten in Verbindung gebracht und in Studien zu neurologischen Funktionsstörungen sowie zur Energetik von Tumorzellen beschrieben, was ihre Bedeutung als Marker und mechanistischer Knotenpunkt in der Forschung zur Energiehomöostase unterstreicht.

creatine kinase-B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CKB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

creatine kinase-B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CKB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CKB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen creatine kinase-B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CKB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von creatine kinase-B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des creatine kinase-B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CKB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.