CRBN CRISPR Activation Plasmid (h): sc-412142-ACT

Das humane CRBN-Gen kodiert Cereblon, einen Substratrezeptor des CUL4–DDB1-E3-Ubiquitin-Ligase-Komplexes, der die Proteinhomöostase steuert, indem er bestimmte Zielproteine zur Ubiquitinierung und zum proteasomalen Abbau dirigiert. Durch die Regulation des ubiquitinabhängigen Proteinabbaus beeinflusst CRBN Transkriptionsprogramme, die Zellzyklusprogression und zelluläre Stressantworten und ist damit in Signalwege eingebunden, die Differenzierung und Immunsignale prägen. CRBN wurde im Kontext der Entwicklungsbiologie und neuronalen Funktion untersucht; Störungen seiner Expression oder Aktivität werden mit veränderter Proteostase und krankheitsrelevanten Phänotypen in Verbindung gebracht. Als zentraler Knotenpunkt der Regulation des Ubiquitin-Proteasom-Systems wird CRBN häufig untersucht, um kontextspezifische Substratauswahl und nachgelagerte Signalkonsequenzen zu verstehen.

CRBN Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CRBN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CRBN Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CRBN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CRBN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CRBN-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CRBN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CRBN-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CRBN-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CRBN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.