Plasmide CRISPR d'Activation (h) connexin 36: sc-402740-ACT

GJD2 code la connexine 36 (Cx36), une protéine de jonction communicante (gap junction) qui s’assemble en canaux intercellulaires permettant un couplage électrique et métabolique direct entre cellules adjacentes. Le couplage médié par Cx36 favorise une décharge synchronisée et des oscillations de réseau, en particulier dans les circuits neuronaux, en autorisant un flux ionique rapide et l’échange de petites molécules à travers les membranes. Dans le système nerveux central et d’autres tissus excitables, la connexine 36 influence l’intégration synaptique, la propagation des signaux et la plasticité dépendante de l’activité via la régulation de l’assemblage et du gating (ouverture/fermeture) des jonctions communicantes. Des altérations de l’expression de GJD2/connexine 36 ou du couplage qu’elle assure ont été impliquées dans des dysfonctionnements neurophysiologiques et sont étudiées dans le contexte de troubles associés à une synchronie neuronale déficiente.

connexin 36 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GJD2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

connexin 36 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GJD2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GJD2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de connexin 36. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GJD2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de connexin 36 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie connexin 36 dans les cellules tumorales présentant une expression de GJD2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.