Conductin Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419278-ACT

Axin2 nel topo codifica Conductin, una proteina scaffold che funge da regolatore chiave di feedback negativo della segnalazione canonica Wnt/β-catenina. Conductin promuove il turnover della β-catenina tramite il complesso di distruzione, modulando così programmi trascrizionali che governano il patterning embrionale, il comportamento delle cellule staminali e progenitrici e l’omeostasi tissutale. In quanto gene bersaglio di Wnt ben consolidato, l’espressione di Axin2 è ampiamente utilizzata come indicatore dell’attivazione della via ed è rilevante per studi sulla segnalazione Wnt deregolata nelle anomalie dello sviluppo e nelle reti di segnalazione associate al cancro. La sua regolazione si interfaccia con decisioni sul destino cellulare, controllo della proliferazione e processi di differenziamento in molteplici sistemi d’organo.

Conductin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Axin2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Conductin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Axin2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Axin2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Conductin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Axin2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Conductin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Conductin nelle cellule tumorali con espressione di Axin2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.