Conductin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401386-ACT

AXIN2 kodiert Conductin, ein Gerüstprotein, das als zentraler negativer Regulator des kanonischen Wnt/β‑Catenin-Signalwegs wirkt, indem es den Zusammenbau des β‑Catenin-Destruktionskomplexes fördert und den Abbau (Turnover) von β‑Catenin erleichtert. Als Transkriptionsziel der Wnt-Signalisierung ist AXIN2 an der Rückkopplungskontrolle von Stärke und Dauer des Signalwegs beteiligt und beeinflusst damit Programme der Zellschicksalsfestlegung, Proliferation und Differenzierung. Eine fehlregulierte AXIN2-Expression oder -Funktion geht mit veränderter Wnt-Signalwegaktivität einher, die mit Entwicklungsstörungen und der Tumorbiologie in Verbindung steht, einschließlich kolorektaler und anderer Wnt-getriebener Malignome. In humanen Zellmodellen dient AXIN2 als Ausleseparameter und Modulator der Wnt-Signalwegdynamik, die für die epitheliale Homöostase sowie die Regulation von Stamm‑/Vorläuferzellen relevant ist.

Conductin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AXIN2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Conductin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AXIN2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AXIN2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Conductin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AXIN2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Conductin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Conductin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AXIN2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.