COL4A5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401199-ACT

COL4A5 kodiert die α5-Kette des Typ-IV-Kollagens, eine zentrale strukturelle Komponente von Basalmembranen, die sich zu heterotrimeren Netzwerken zusammenlagert und so die Gewebearchitektur sowie die selektive Filtration unterstützt. In Nierenglomeruli, der Cochlea und okulären Geweben beeinflussen COL4A5-haltige Kollagen-IV-Gerüste die Zell-Matrix-Adhäsion, die Mechanotransduktion und die Organisation der extrazellulären Matrix und sind dabei in Signalwege eingebunden, die über Integrine, fokale Adhäsionskomplexe und Enzyme des Matrix-Remodelings vermittelt werden. Eine veränderte COL4A5-Expression oder beeinträchtigte Netzwerkintegrität stört Stabilität und Permeabilität der Basalmembran und trägt zu hereditären Nephropathien und damit verbundenen sensorischen Phänotypen bei. Daher wird COL4A5 breit in der Epithel- und Endothelbiologie, der Dynamik der extrazellulären Matrix und in Modellen der Basalmembrandysfunktion untersucht.

COL4A5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen COL4A5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

COL4A5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des COL4A5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der COL4A5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen COL4A5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native COL4A5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von COL4A5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des COL4A5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem COL4A5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.