COL2A1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400359-ACT

COL2A1 codifica la catena α1 del collagene di tipo II, un importante componente fibrillare della matrice extracellulare della cartilagine, che sostiene la resistenza alla trazione e l’idratazione del tessuto tramite interazioni con i proteoglicani. La sua espressione è strettamente legata alla differenziazione dei condrociti e ai programmi di assemblaggio della matrice, coordinati da reti trascrizionali guidate da SOX9 e da vie di rimodellamento della matrice extracellulare. L’alterazione di COL2A1 compromette l’integrità strutturale della cartilagine e può interferire con i processi di sviluppo endocondrale rilevanti per la biologia dello scheletro e delle articolazioni. La variazione genetica o l’espressione disregolata di COL2A1 è stata associata a displasie ereditarie della cartilagine e dello scheletro, rendendolo un bersaglio frequente per lo studio dell’omeostasi della matrice extracellulare e della regolazione della linea condrocitaria.

COL2A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di COL2A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

COL2A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus COL2A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione COL2A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di COL2A1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus COL2A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da COL2A1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via COL2A1 nelle cellule tumorali con espressione di COL2A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.