Plásmido CRISPR de Activación (h) CNT2: sc-409209-ACT

SLC28A2 codifica el transportador concentrativo de nucleósidos 2 (CNT2), un transportador de alta afinidad dependiente de sodio que media la captación celular de nucleósidos purínicos como la adenosina y la inosina a través de la membrana plasmática. Al controlar la vía de rescate de nucleósidos y los reservorios intracelulares de nucleótidos, CNT2 influye en el metabolismo energético, la síntesis de ácidos nucleicos y las vías de señalización purinérgica que modulan las respuestas celulares al estrés. La actividad de CNT2 es especialmente relevante en tejidos con un alto flujo de nucleósidos, como el intestino y el riñón, y contribuye a contextos de farmacología y toxicología en los que el manejo de análogos de nucleósidos es una variable clave. La desregulación del transporte de nucleósidos se ha vinculado con estados metabólicos alterados y con la remodelación asociada a enfermedades de la homeostasis de nucleótidos, lo que convierte a SLC28A2 en una diana útil para estudios mecanísticos de cambios de vías impulsados por el transporte.

CNT2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SLC28A2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CNT2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SLC28A2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SLC28A2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CNT2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SLC28A2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CNT2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CNT2 en células tumorales con expresión de SLC28A2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.