CNT1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404790-ACT

SLC28A1 kodiert den konzentrativen Nukleosidtransporter 1 (CNT1), einen hochaffinen, natriumabhängigen Transporter in der Plasmamembran, der die zelluläre Aufnahme von Pyrimidin-Nukleosiden wie Uridin und Cytidin vermittelt. Durch die Kontrolle des Nukleosid-„Salvage“-Stoffwechsels unterstützt CNT1 die Homöostase der Nukleotidpools, die für die DNA-/RNA-Synthese, die Zellzyklusprogression und die Reaktionen auf metabolischen Stress erforderlich ist. Die CNT1-Aktivität überschneidet sich mit dem Purin-/Pyrimidinstoffwechsel und kann die Empfindlichkeit gegenüber auf Nukleosidanaloga basierenden experimentellen Perturbationen über eine veränderte intrazelluläre Substratverfügbarkeit beeinflussen. Eine dysregulierte SLC28A1-Expression wurde in mehreren Krankheitskontexten beschrieben, einschließlich krebsassoziierter metabolischer Reprogrammierung, was sie für Studien zur Transporterbiologie, Proliferation und zu Arzneistoff-Transportmechanismen relevant macht.

CNT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC28A1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CNT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC28A1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC28A1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CNT1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC28A1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CNT1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CNT1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC28A1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.