CNPase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402463-ACT

Das humane CNP-Gen kodiert die 2′,3′-cyclische Nukleotid-3′-Phosphodiesterase (CNPase), ein reichlich vorhandenes, myelinassoziiertes Enzym, das mit der Reifung von Oligodendrozyten, der Aufrechterhaltung der Myelinscheide und der Organisation des Zytoskeletts in Verbindung gebracht wird. CNPase hydrolysiert 2′,3′-cyclische Nukleotide und ist an RNA-assoziierten Prozessen sowie an Membran–Zytoskelett-Interaktionen beteiligt, die das Auswachsen glialer Fortsätze und die Axon–Glia-Kopplung beeinflussen. Veränderte CNP-Expression oder -Aktivität wurde mit Demyelinisierungs-Phänotypen und neuroinflammatorischen Kontexten verknüpft, was das Gen für Studien zur Integrität der weißen Substanz und zur neuronalen Konnektivität relevant macht. Als glia-angereicherter Marker wird CNPase häufig genutzt, um Signalwege zu untersuchen, die die Myelinisierung steuern, Stressantworten in Oligodendrozyten zu analysieren und Mechanismen aufzuklären, die einer Myelinininstabilität zugrunde liegen.

CNPase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CNP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CNPase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CNP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CNP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CNPase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CNP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CNPase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CNPase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CNP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.