CLK4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404084-ACT

CDC-like Kinase 4 (CLK4) ist eine dual-spezifische Serin/Threonin-Kinase, die SR-Spleißfaktoren phosphoryliert und so Signaleingänge mit Entscheidungen der alternativen prä‑mRNA‑Spleißung verknüpft. Als Teil der CLK/SRPK‑Regulationsachse trägt CLK4 zur Kontrolle der Spleißosomen-Dynamik, der Exon-Inklusion und des Gleichgewichts von Transkript-Isoformen bei und formt dadurch Genexpressionsprogramme, die den Zellzyklusverlauf und Stressantworten beeinflussen. Fehlregulierte Spleißvorgänge und veränderte Aktivität der CLK‑Familie wurden in menschlichen Zellen mit onkogener transkriptioneller Umprogrammierung und weiteren krankheitsrelevanten Phänotypen in Verbindung gebracht. Die Untersuchung der CLK4‑Funktion unterstützt mechanistische Analysen von RNA‑Prozessierungswegen und deren Beitrag zu Veränderungen des zellulären Zustands.

CLK4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CLK4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CLK4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CLK4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CLK4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CLK4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CLK4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CLK4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CLK4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CLK4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.