CLC-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403513-ACT

Das humane Gen **CLCN2** kodiert den spannungsabhängigen Chloridkanal **CLC-2**, einen Transporter der Plasma- und Endomembranen, der die Chloridleitfähigkeit, die Stabilisierung des Membranpotenzials sowie die Ionen- und Flüssigkeitshomöostase in Epithelien unterstützt. Die Aktivität von CLC-2 trägt zu transepithelialen Transportprozessen bei und steht in Wechselwirkung mit Signalprogrammen, die intrazelluläres Chlorid als Regulator der Zellvolumenkontrolle und der elektrischen Erregbarkeit nutzen. Im Nervensystem beeinflusst CLC-2 den Umgang mit Chlorid und kann dadurch die inhibitorische Neurotransmission mitprägen, indem es zelluläre Chloridgradienten moduliert. Eine fehlregulierte CLCN2-Expression oder eine gestörte Kanalfunktion wurde mit neurologischen Phänotypen und Leukoenzephalopathie in Verbindung gebracht; zudem ist CLCN2 für Untersuchungen der epithelialen Barrierephysiologie und von Ionenkanal- bzw. Ionentransportstörungen relevant.

CLC-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CLCN2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CLC-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CLCN2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CLCN2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CLC-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CLCN2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CLC-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CLC-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CLCN2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.