Claspin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404153-ACT

Il gene umano **CLSPN** codifica **Claspin**, un mediatore del checkpoint di replicazione che collega la segnalazione di **ATR** all’attivazione di **CHK1** in risposta allo stress replicativo e al danno al DNA. Claspin coordina la stabilizzazione delle forcelle di replicazione bloccate, l’applicazione del checkpoint in fase S e la tempistica dell’attivazione delle origini di replicazione per preservare l’integrità del genoma. La sua attività interseca le vie della replicazione del DNA, della risposta al danno del DNA e del controllo del ciclo cellulare, e un’alterata segnalazione dei checkpoint è stata associata all’instabilità genomica osservata in diversi tipi di cancro e in disturbi ereditari della manutenzione del genoma. **CLSPN** è quindi studiato di routine nei meccanismi di tolleranza allo stress replicativo, nella fragilità cromosomica e nella sensibilità a perturbazioni genotossiche.

Claspin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CLSPN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Claspin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CLSPN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CLSPN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Claspin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CLSPN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Claspin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Claspin nelle cellule tumorali con espressione di CLSPN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.