Plasmide CRISPR d'Activation (h) Claspin: sc-404153-ACT

Le gène humain **CLSPN** code la **claspine**, un médiateur du point de contrôle de la réplication qui relie la signalisation **ATR** à l’activation de **CHK1** en réponse au stress réplicatif et aux dommages de l’ADN. La claspine coordonne la stabilisation des fourches de réplication bloquées, l’application du point de contrôle de la phase S et le calendrier d’activation des origines afin de préserver l’intégrité du génome. Son activité s’inscrit à l’interface des voies de réplication de l’ADN, de réponse aux dommages de l’ADN et de contrôle du cycle cellulaire, et une signalisation de point de contrôle altérée a été associée à l’instabilité génomique observée dans divers cancers et troubles héréditaires de maintenance du génome. **CLSPN** est donc couramment étudié dans les mécanismes de tolérance au stress réplicatif, de fragilité chromosomique et de sensibilité aux perturbations génotoxiques.

Claspin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CLSPN sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Claspin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CLSPN dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CLSPN, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Claspin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CLSPN natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Claspin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Claspin dans les cellules tumorales présentant une expression de CLSPN silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.