CKR-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404778-ACT

Il CCR4 umano (CKR-4) è un recettore per chemochine della famiglia dei GPCR che lega ligandi come CCL17 e CCL22 per guidare la chemiotassi, il posizionamento cellulare e i programmi di attivazione nelle cellule immunitarie. La segnalazione di CCR4 coinvolge proteine G eterotrimeriche e vie a valle tra cui PI3K–AKT, MAPK e i flussi di calcio, modellando il traffico cellulare e le risposte citochiniche nel microambiente tissutale. È spesso studiato nel contesto della localizzazione dei sottotipi di cellule T e delle interazioni tumore–sistema immunitario, dove un’espressione alterata del recettore può influenzare i pattern di infiltrazione e la regolazione immunitaria. Una disregolazione dell’espressione di CCR4 è stata associata a stati infiammatori e neoplasie, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici sulla migrazione delle cellule immunitarie e sui segnali del microambiente.

CKR-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCR4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CKR-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCR4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCR4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CKR-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCR4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CKR-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CKR-4 nelle cellule tumorali con espressione di CCR4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.