ChoK CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403793-ACT

Das humane Gen **CHKA** kodiert die Cholin-Kinase alpha (ChoK), ein ATP-abhängiges Enzym, das die Phosphorylierung von Cholin zu Phosphocholin katalysiert – ein geschwindigkeitsbestimmender Schritt im Kennedy-Weg der Phosphatidylcholin-Biosynthese. Durch die Kontrolle der Phosphocholin-Pools und der Produktion von Membranphospholipiden unterstützt ChoK die zelluläre Membranbiogenese, die Lipid-Signalgebung sowie das mit Proliferation und Stressantworten verbundene metabolische Remodelling. Die Aktivität von CHKA überschneidet sich mit onkogenen Signalprogrammen und dem veränderten Cholin-Stoffwechsel, der bei zahlreichen Tumorarten beobachtet wird; darüber hinaus wurde CHKA im Zusammenhang mit entzündlichen und neurodegenerativen Prozessen über eine allgemeinere Rolle in der Phospholipid-Homöostase beschrieben. Als metabolischer Knotenpunkt, der Nährstoffverwertung mit Membrandynamik verknüpft, wird CHKA häufig in Signalwegen untersucht, die Zellwachstum, Migration und Organellenfunktion steuern.

ChoK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CHKA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ChoK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CHKA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CHKA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ChoK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CHKA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ChoK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ChoK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CHKA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.