cGKII CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404138-ACT

PRKG2 kodiert die cGMP-abhängige Proteinkinase II (cGKII), eine membranassoziierte Serin/Threonin-Kinase, die Stickstoffmonoxid–cGMP-Signale in Phosphorylierungsprogramme überführt, welche Ionentransport, Sekretion und die Physiologie der epithelialen Barriere steuern. cGKII moduliert CFTR und andere Kanäle/Transporter und ist in die cGMP/PKG-Signalübertragung eingebunden, wodurch sie die zelluläre Homöostase in Geweben wie Darm, Niere und Knochen beeinflusst. In der Wachstumsfuge begrenzt die PRKG2-Aktivität die hypertrophe Differenzierung von Chondrozyten und unterstützt die enchondrale Ossifikation, wodurch dieser Signalweg mit der Regulation des Skelettwachstums verknüpft ist. Eine dysregulierte PRKG2-Signalgebung wurde mit Entwicklungsphänotypen des Knochens sowie mit umfassenderen Veränderungen des cGMP-Signalwegs in Verbindung gebracht, die für die Epithelfunktion und Studien zur zellulären Signalübertragung relevant sind.

cGKII Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRKG2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

cGKII Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRKG2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRKG2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen cGKII-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRKG2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von cGKII-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des cGKII-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRKG2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.