CDC42 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-418353-ACT

CDC42 kodiert eine ubiquitär exprimierte kleine GTPase der Rho-Familie, die als molekularer Schalter wirkt und den Umbau des Aktin-Zytoskeletts, die Zellpolarität, den vesikulären Transport sowie die Progression des Zellzyklus steuert. Durch den Wechsel zwischen GDP- und GTP-gebundenen Zuständen koordiniert CDC42 die Signalweiterleitung über Effektorproteine wie PAKs, WASP/N-WASP und den PAR-Polaritätskomplex und verknüpft so Rezeptorsignale mit zytoskelettaler Dynamik und Transkriptionsprogrammen. Die CDC42-Aktivität ist mit Signalwegen wie PI3K–AKT, MAPK und integrinvermittelter Adhäsion vernetzt und reguliert Migration, Endozytose und die Integrität von Zell-Zell-Kontakten. Eine fehlregulierte CDC42-Signalgebung wurde mit veränderter Funktion von Immunzellen, neuroentwicklungsbedingten Auffälligkeiten und onkogenen Phänotypen in Verbindung gebracht, die durch abnorme Motilität und Invasion gekennzeichnet sind.

CDC42 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CDC42-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CDC42 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CDC42-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CDC42-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CDC42-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CDC42-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CDC42-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CDC42-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CDC42-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.