Plasmide CRISPR d'Activation (h) CD77 synthase: sc-404828-ACT

A4GALT code la synthase CD77, une glycosyltransférase localisée dans l’appareil de Golgi qui catalyse l’ajout de galactose au lactosylcéramide pour générer le globotriaosylcéramide (Gb3/CD77), un glycosphingolipide neutre majeur. En modulant la biosynthèse des glycosphingolipides, la synthase CD77 influence l’organisation des microdomaines membranaires, le trafic des protéines et les processus de reconnaissance cellule–cellule, pertinents pour la biologie des cellules immunitaires et épithéliales. Des altérations de l’activité d’A4GALT et de l’abondance de CD77/Gb3 ont été associées à des changements de l’état de différenciation et à la susceptibilité à des interactions dépendantes des glycannes, notamment des voies impliquées dans la biologie des lymphocytes B et des phénotypes de glycosylation associés aux tumeurs. Ainsi, A4GALT est fréquemment étudié dans le contexte du métabolisme des glycosphingolipides, du remodelage du glycocalyx (glycome) et de la régulation des antigènes de surface cellulaire.

CD77 synthase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de A4GALT sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CD77 synthase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus A4GALT dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription A4GALT, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CD77 synthase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus A4GALT natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CD77 synthase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CD77 synthase dans les cellules tumorales présentant une expression de A4GALT silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.