CD68 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400211-ACT

CD68 (auch als Makrosialin bekannt) kodiert ein stark glykosyliertes lysosomales/endosomales Membranprotein, das in Monozyten, Makrophagen und Mikroglia besonders stark angereichert ist und dort häufig als Marker für die Häufigkeit von Phagolysosomen sowie den Aktivierungszustand myeloider Zellen verwendet wird. CD68 ist an endozytotischem Transport und phagozytoseassoziierten Prozessen beteiligt und verknüpft Signale der angeborenen Immunität mit der Lysosomenfunktion und der Antigenverarbeitung. Eine veränderte CD68-Expression begleitet die Aktivierung von Makrophagen und Mikroglia in Zusammenhängen wie entzündlichem Gewebeumbau, metabolischer Dysfunktion und Neuroinflammation und spiegelt Verschiebungen in Programmen der myeloiden Differenzierung und Aktivierung wider. Als Ausleseparameter für den Zustand myeloider Zellen wird CD68 häufig zusammen mit Zytokin-, Interferon- und Lipidstoffwechselwegen untersucht, um den zellulären Phänotyp mit Immunmikroumgebungen in Beziehung zu setzen.

CD68 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CD68-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CD68 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CD68-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CD68-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CD68-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CD68-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CD68-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CD68-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CD68-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.