CD40 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423444-ACT

Das murine Cd40 kodiert CD40, ein kostimulatorisches Molekül der TNF-Rezeptor-Superfamilie, das auf antigenpräsentierenden Zellen exprimiert wird und über CD40–CD40L-Interaktionen die adaptive Immunantwort koordiniert. Die CD40-Signalgebung aktiviert die NF-κB-, MAPK- und PI3K-Signalwege und fördert dadurch die Reifung dendritischer Zellen, die Proliferation von B-Zellen, den Klassenwechsel der Immunglobuline sowie die Bildung von Keimzentren. Durch Crosstalk mit Zytokin- und Mustererkennungsrezeptor-Programmen prägt CD40 das T-Zell-Priming und die entzündliche Polarisierung. Eine fehlregulierte CD40-Aktivität wird in Modellen von Autoimmunität, chronischer Entzündung, Transplantatabstoßung und der Regulation der Tumor-Immun-Mikroumgebung beschrieben und macht CD40 damit zu einem zentralen Knotenpunkt für mechanistische immunologische Studien in Mausmodellen.

CD40 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Cd40-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CD40 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Cd40-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Cd40-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CD40-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Cd40-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CD40-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CD40-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Cd40-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.