CD14 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400344-ACT

Humanes CD14 kodiert einen über einen Glycosylphosphatidylinositol-(GPI)-Anker membranständig gebundenen Korezeptor, der vorwiegend auf Monozyten, Makrophagen und Neutrophilen exprimiert wird und die angeborene Immunerkennung von bakteriellem Lipopolysaccharid sowie anderen pathogenassoziierten Liganden verstärkt. CD14 wirkt mit TLR4–MD-2 und LBP zusammen, um MyD88- und TRIF-abhängige Signalwege zu fördern, wodurch NF-κB- und IRF-vermittelte inflammatorische Transkriptionsprogramme und die Zytokinproduktion ausgelöst werden. Als Regulator der Endotoxin-Erkennung und myeloider Aktivierungszustände werden veränderte CD14-Expression und Signaldynamiken häufig im Kontext der Infektionsbiologie, chronisch-entzündlicher Erkrankungen und Immunfehlregulation untersucht. CD14 dient zudem als Marker und funktioneller Modulator in Analysen der Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen, der Polarisation und der Reaktionen auf mikroumgebungsbedingte Signale.

CD14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CD14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CD14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CD14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CD14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CD14-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CD14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CD14-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CD14-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CD14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.