Plasmide CRISPR d'Activation (h) CCRK: sc-409545-ACT

CDK20 code pour la kinase liée au cycle cellulaire CCRK (Cell Cycle-Related Kinase), une sérine/thréonine kinase qui régule la progression du cycle cellulaire et les signaux prolifératifs via un contrôle, dépendant de la phosphorylation, des voies associées aux CDK. CCRK a été associée à la modulation de l’activité Wnt/β-caténine et à des programmes transcriptionnels plus larges influençant la croissance, la différenciation et l’homéostasie cellulaire. Des altérations de l’expression de CDK20/CCRK ont été rapportées dans plusieurs contextes pertinents pour les maladies, notamment une prolifération dérégulée et des modifications de l’équilibre des réseaux de signalisation en biologie du cancer. Par conséquent, CDK20 est fréquemment étudié pour son rôle dans la signalisation des kinases, le contrôle du cycle cellulaire et le dialogue entre voies (crosstalk) dans les cellules humaines.

CCRK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CDK20 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CCRK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CDK20 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CDK20, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CCRK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CDK20 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CCRK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CCRK dans les cellules tumorales présentant une expression de CDK20 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.