cathepsin B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400360-ACT

CTSB kodiert die lysosomale Cysteinprotease Cathepsin B, einen zentralen Vermittler des intrazellulären Proteinumsatzes und des endolysosomalen Umbaus. Cathepsin B ist an der lysosomenabhängigen Katabolisierung, der Wechselwirkung zwischen Autophagie und Lysosomen sowie an der regulierten Prozessierung von Proteinen in endozytotischen Kompartimenten beteiligt; zusätzlich übernimmt es beim Sekretions- oder Umverteilungsprozess Aufgaben im Umbau der extrazellulären Matrix. Eine veränderte CTSB-Expression oder -Aktivität wurde mit Änderungen der Antigenprozessierung, inflammasomassoziierten Antworten und Proteostase-Stresssignalwegen in Verbindung gebracht, die das Zellüberleben und die Gewebeumgestaltung beeinflussen. Eine Fehlregulation von Cathepsin B wird häufig im Kontext von Krebsinvasion und Metastasierung, Neurodegeneration und entzündlichen Erkrankungen untersucht, bei denen Verschiebungen der lysosomalen Funktion und des Proteasegleichgewichts zu krankheitsrelevanten Phänotypen beitragen.

cathepsin B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CTSB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

cathepsin B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CTSB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CTSB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen cathepsin B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CTSB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von cathepsin B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des cathepsin B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CTSB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.