Plasmide CRISPR d'Activation (h) CaMKII delta: sc-400811-ACT

CAMK2D code l’isoforme delta de la protéine kinase II dépendante du Ca2+/calmoduline (CaMKII delta), une kinase sérine/thréonine qui convertit les transitoires de calcium intracellulaire en sorties de signalisation dépendantes de la phosphorylation. CaMKII delta régule le couplage excitation–contraction, l’homéostasie du calcium et des programmes transcriptionnels dépendants de l’activité via des cibles allant des canaux ioniques aux protéines du réticulum sarcoplasmique, ainsi que des effecteurs en aval incluant les réseaux associés à MAPK et à CREB. Dans les tissus humains, l’activité de CAMK2D est étroitement liée à la signalisation cardiaque et vasculaire, où une régulation altérée de CaMKII delta peut remodeler les voies sensibles au stress, l’électrophysiologie et le remodelage cellulaire. Une signalisation calcique déréglée et des événements de phosphorylation dépendants de CaMKII ont été associés à des pathologies cardiovasculaires et, plus largement, à des défauts de signalisation dépendante du calcium pertinents pour des études mécanistiques des maladies.

CaMKII delta Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CAMK2D sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CaMKII delta Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CAMK2D dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CAMK2D, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CaMKII delta. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CAMK2D natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CaMKII delta au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CaMKII delta dans les cellules tumorales présentant une expression de CAMK2D silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.