calsequestrin 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402912-ACT

CASQ2 codifica la calsequestrina 2, la principale proteina legante il Ca2+ nel lume del reticolo sarcoplasmatico dei cardiomiociti, che tampona il calcio intraluminale e contribuisce a modellare l’accoppiamento eccitazione–contrazione. Organizzando l’immagazzinamento e il rilascio di Ca2+ in prossimità dei complessi del recettore della rianodina, la calsequestrina 2 influenza il rilascio di calcio indotto dal calcio, il ricaricamento del RS e la segnalazione dell’omeostasi del calcio. Alterazioni dell’espressione o della funzione di CASQ2 modificano il carico di Ca2+ nel RS e la dinamica del rilascio, contribuendo a un’anomala gestione del calcio e a fenotipi cellulari aritmogenici. Queste caratteristiche rendono CASQ2 un nodo chiave per studiare il ciclo del calcio cardiaco, le risposte allo stress e i meccanismi che collegano la disregolazione del calcio del RS ai disturbi del ritmo ereditari.

calsequestrin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CASQ2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

calsequestrin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CASQ2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CASQ2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di calsequestrin 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CASQ2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da calsequestrin 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via calsequestrin 2 nelle cellule tumorali con espressione di CASQ2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.