Calpastatin CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419474-ACT

Mouse Cast kodiert Calpastatin, den endogenen Inhibitor der calciumabhängigen Calpain-Proteasen, der die begrenzte Proteolyse von zytoskelettalen und Signaltransduktions-Substraten einschränkt. Durch die Feinabstimmung der Calpain-Aktivität trägt Calpastatin zur Regulation des zytoskelettalen Umbaus, des Turnovers fokaler Adhäsionen, des Membrantransports und der Apoptose bei, mit nachgeschalteten Effekten auf inflammatorische Signalwege und Stressantworten. Das Gleichgewicht zwischen CAST und Calpain ist breit relevant für die Gewebeintegrität in Muskulatur und Nervensystem; seine Dysregulation wurde in der Literatur mit Mechanismen in Verbindung gebracht, die Myopathien, Neurodegeneration und eine veränderte Aktivierung von Immunzellen zugrunde liegen. In Zell- und Tiermodellen wird die Modulation der Cast-Expression eingesetzt, um proteasegetriebene Umbauprogramme und calciumabhängige Signalnetzwerke zu untersuchen.

Calpastatin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Cast-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Calpastatin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Cast-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Cast-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Calpastatin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Cast-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Calpastatin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Calpastatin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Cast-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.