CA VIII Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403750-ACT

Il gene umano **CA8** codifica l’anidrasi carbonica VIII (CA VIII), una proteina correlata alle anidrasi carboniche ma priva di attività catalitica, che modula la segnalazione neuronale piuttosto che l’idratazione della CO₂. CA VIII è fortemente arricchita nel sistema nervoso centrale e regola la dinamica del calcio intracellulare attraverso l’interazione con le vie del recettore dell’inositolo 1,4,5-trifosfato, influenzando l’eccitabilità delle cellule di Purkinje e la funzione sinaptica. Alterazioni dell’espressione o della funzione di CA8 sono state associate a fenotipi di neurosviluppo e di coordinazione motoria, a supporto della sua rilevanza per i circuiti cerebellari e le reti di segnalazione calcio-dipendenti. In quanto membro non enzimatico della famiglia delle CA, CA VIII rappresenta anche un modello per analizzare i ruoli “da scaffold” degli pseudoenzimi nella segnalazione cellulare.

CA VIII Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CA8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CA VIII Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CA8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CA8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CA VIII. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CA8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CA VIII nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CA VIII nelle cellule tumorali con espressione di CA8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.