C9orf41 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409368-ACT

CARNMT1 kodiert das humane Protein C9orf41, eine S-Adenosyl-L-methionin-abhängige Methyltransferase, die über die Methylierung des cap-nahen Adenosins (Am) zur Bildung von N6,2′-O-Dimethyladenosin (m6Am) am 5′-Ende ausgewählter Transkripte in den RNA-Stoffwechsel eingebunden ist. Diese epitranskriptomische Modifikation kann die mRNA-Stabilität und die Translationseffizienz beeinflussen und verknüpft die Aktivität von C9orf41 mit der posttranskriptionellen Genregulation und der Proteostase. Veränderte, cap-assoziierte RNA-Methylierung sowie dysregulierte RNA-Prozessierungswege sind wiederkehrende Merkmale in Datensätzen zu unterschiedlichen Krebserkrankungen und neurologischen Erkrankungen, was CARNMT1 zu einem geeigneten Knotenpunkt für mechanistische Studien der Kopplung von Transkription und Translation macht. Die Modulation der C9orf41-Expression ermöglicht die Untersuchung, wie m6Am-Dynamiken Zellzustandsübergänge, Stressantworten und signalwegspezifische Genexpressionsprogramme prägen.

C9orf41 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CARNMT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

C9orf41 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CARNMT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CARNMT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen C9orf41-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CARNMT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von C9orf41-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des C9orf41-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CARNMT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.