C9orf152 CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-415979-ACT-2

Das humane Gen C9orf152 kodiert ein bislang weitgehend uncharakterisiertes Protein, für das sich jedoch zunehmend Hinweise auf Funktionen in der zellulären Homöostase und in regulatorischen Prozessen finden; dies wird durch Expressionsmuster und Koexpressionsnetzwerke gestützt, die sowohl nukleäre als auch zytoplasmatische Aufgaben nahelegen. Transkriptomische Analysen deuten auf eine mögliche Beteiligung an Signalwegen sowie an Kontrollmechanismen der Genexpression hin, die mit Zellzyklusregulation und Stressantworten verknüpft sind, wodurch C9orf152 ein geeignetes Ziel für die Untersuchung bislang schlecht annotierter regulatorischer Knotenpunkte darstellt. Eine veränderte Expression von C9orf152 wurde in verschiedenen krankheitsassoziierten Datensätzen, einschließlich krebsbezogener Profile, beschrieben, was die Relevanz für mechanistische Studien zu fehlregulierten Transkriptionsprogrammen und zellulärer Anpassung unterstreicht. Das Gene-Editing von C9orf152 ermöglicht eine funktionelle Untersuchung durch Knock-out oder präzises Variantenmodellieren, um nachgeschaltete Pathway-Effekte, Protein-Interaktionsnetzwerke sowie Phänotyp-Genotyp-Beziehungen in humanen Zellsystemen zu kartieren.

C9orf152 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen C9orf152-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

C9orf152 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des C9orf152-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der C9orf152-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen C9orf152-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native C9orf152-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von C9orf152-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des C9orf152-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem C9orf152-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.