BMAL1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400808-ACT

ARNTL (BMAL1) ist ein zentraler basischer bHLH‑PAS-Transkriptionsfaktor, der mit CLOCK/NPAS2 Heterodimere bildet und über E‑Box-Elemente circadiane Genexpressionsprogramme antreibt. Dieser Komplex reguliert tägliche Oszillationen des Stoffwechsels, der mitochondrialen Funktion, des Redox-Gleichgewichts, der DNA-Schadensantworten und der Immun-Signalgebung und koordiniert transkriptionelle Rückkopplungsschleifen mit den Repressoren PER und CRY. In der Humanbiologie wurde eine veränderte BMAL1-Aktivität mit Störungen des circadianen Rhythmus in Verbindung gebracht, mit nachgelagerten Auswirkungen auf die metabolische Homöostase, inflammatorische Signalwege, neurobehaviorale Phänotypen und die zelluläre Stressresilienz. BMAL1 ist zudem in Hypoxie- und Kernrezeptor-Netzwerke eingebunden und stellt damit einen nützlichen Knotenpunkt dar, um die zeitliche Regulation der Transkription und die Physiologie auf Systemebene in vitro zu untersuchen.

BMAL1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ARNTL-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BMAL1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ARNTL-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ARNTL-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BMAL1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ARNTL-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BMAL1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BMAL1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ARNTL-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.