Plasmide CRISPR d'Activation (h) BMAL1: sc-400808-ACT

ARNTL (BMAL1) est un facteur de transcription fondamental de type hélice-boucle-hélice basique (bHLH) contenant un domaine PAS, qui s’hétérodimérise avec CLOCK/NPAS2 pour piloter les programmes d’expression génique circadienne via des éléments E-box. Ce complexe régule les oscillations quotidiennes du métabolisme, de la fonction mitochondriale, de l’équilibre rédox, des réponses aux dommages de l’ADN et de la signalisation immunitaire, en coordonnant des boucles de rétroaction transcriptionnelle avec les répresseurs PER et CRY. En biologie humaine, une activité altérée de BMAL1 a été associée à une perturbation des rythmes circadiens, avec des répercussions en aval sur l’homéostasie métabolique, les voies inflammatoires, les phénotypes neurocomportementaux et la résistance cellulaire au stress. BMAL1 s’inscrit aussi à l’interface des réseaux de l’hypoxie et des récepteurs nucléaires, ce qui en fait un nœud utile pour étudier in vitro la régulation temporelle de la transcription et la physiologie à l’échelle des systèmes.

BMAL1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ARNTL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

BMAL1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ARNTL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ARNTL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de BMAL1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ARNTL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de BMAL1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie BMAL1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ARNTL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.