Plasmide CRISPR d'Activation (h) BLM: sc-400896-ACT

BLM code une hélicase d’ADN de la famille RecQ qui préserve la stabilité du génome en résolvant des structures d’ADN aberrantes lors de la réplication et de la recombinaison. BLM intervient dans la réparation par recombinaison homologue, le redémarrage des fourches de réplication et la dissolution des doubles jonctions de Holliday avec le complexe TOP3A–RMI1/2, limitant ainsi les échanges entre chromatides sœurs et les remaniements chromosomiques. Elle s’intègre aux réseaux de réponse aux dommages de l’ADN impliquant la signalisation ATR/ATM et influence le contrôle des points de contrôle du cycle cellulaire en condition de stress réplicatif. La perte d’activité de BLM est associée à une charge mutationnelle accrue et à des phénotypes d’instabilité chromosomique caractéristiques du syndrome de Bloom, et elle est pertinente pour l’étude des défauts de maintenance du génome associés aux cancers.

BLM Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BLM sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

BLM Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BLM dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BLM, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de BLM. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BLM natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de BLM au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie BLM dans les cellules tumorales présentant une expression de BLM silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.