Bex4 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-436560-ACT

Mouse Bex4 (brain expressed X-linked 4) codifica una piccola proteina in gran parte neuronale, implicata in programmi trascrizionali regolati durante lo sviluppo e nella differenziazione neuronale. In quanto membro della famiglia BEX, Bex4 è collegato a reti di segnalazione e di risposta allo stress che influenzano la sopravvivenza cellulare e la specificazione di linea, con interazioni dipendenti dal contesto riportate come in grado di modulare vie associate alle neurotrofine. L’espressione è arricchita nel cervello e in altri contesti neuroectodermici, rendendo Bex4 un nodo utile per studiare la maturazione neuronale, la dinamica di assoni e dendriti e la regolazione genica dipendente dall’attività. Pattern di espressione deregolati della famiglia BEX sono stati associati a fenotipi neuroevolutivi e a stati trascrizionali legati al cancro, a supporto di ricerche meccanicistiche su come Bex4 moduli le transizioni di stato cellulare.

Bex4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Bex4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Bex4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Bex4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Bex4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Bex4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Bex4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Bex4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Bex4 nelle cellule tumorali con espressione di Bex4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.