BCKDE1A CRISPR Activationプラスミド (h): sc-417950-ACT

BCKDHAは、分岐鎖α-ケト酸デヒドロゲナーゼ（BCKDH）複合体を構成するE1αサブユニットをコードしている。BCKDH複合体はミトコンドリアに存在する多酵素系で、ロイシン、イソロイシン、バリンに由来する分岐鎖α-ケト酸の酸化的脱炭酸反応を触媒する。この反応は分岐鎖アミノ酸分解代謝の中核をなし、栄養状態をアセチルCoA／スクシニルCoA産生、ミトコンドリアの酸化還元バランス、ならびに細胞のエネルギー代謝へと結び付けている。BCKDH活性はリン酸化と脱リン酸化によって厳密に制御され、BCKDKおよびPPM1Kからのシグナルを統合して代謝フラックスを調節する。BCKDHAの制御異常やBCKDH機能低下は先天性代謝異常と関連しており、ミトコンドリア機能障害やアミノ酸恒常性の変化という文脈で広く研究されている。

BCKDE1A CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性BCKDHAの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

BCKDE1A CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における BCKDHA 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はBCKDHA転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性BCKDE1Aの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のBCKDHA遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるBCKDE1A依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびBCKDHA発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるBCKDE1A経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。