Plasmide CRISPR d'Activation (h) BCAP: sc-404405-ACT

PIK3AP1 code pour BCAP (« B cell adaptor for PI3K »), une protéine d’échafaudage de signalisation qui couple les signaux provenant des récepteurs de l’antigène et des récepteurs de l’immunité innée à l’activation de la PI3K de classe I dans les cellules hématopoïétiques. Par ses interactions avec des récepteurs contenant des phosphotyrosines et avec des composants régulateurs de la PI3K, BCAP favorise la signalisation en aval AKT/mTOR, influence les sorties des voies NF-κB et MAPK, et contribue à façonner les programmes de production de cytokines, de survie et de différenciation. En immunologie humaine, une signalisation PIK3AP1/BCAP altérée a été associée à une dérégulation des réponses des cellules B et des cellules myéloïdes, contribuant à des phénotypes inflammatoires et à des dysfonctionnements du système immunitaire. Sa position dans la voie en fait un nœud utile pour étudier l’intégration des signaux en amont des récepteurs et le contrôle par rétroaction des états d’activation des cellules immunitaires.

BCAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PIK3AP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

BCAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PIK3AP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PIK3AP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de BCAP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PIK3AP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de BCAP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie BCAP dans les cellules tumorales présentant une expression de PIK3AP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.