Bag-3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402929-ACT

BAG3 (Bag-3) ist ein stressinduzierbarer Co-Chaperon, der an HSP70/HSC70 bindet, um die Proteinkontrolle zu koordinieren, und dabei Proteostase, Autophagie und Apoptose in menschlichen Zellen ausbalanciert. Es unterstützt die chaperonvermittelte selektive Autophagie und beeinflusst die Organisation des Zytoskeletts, die Zelladhäsion und die Mechanotransduktion, insbesondere unter proteotoxischem oder oxidativem Stress. Über diese Funktionen trägt BAG3 zur Regulation von Zellsurvival-Signalwegen und zum Abbau geschädigter oder aggregationsanfälliger Proteine bei. Eine fehlregulierte BAG3-Expression oder -Funktion wurde mit Kardiomyopathien und neuromuskulären Erkrankungen in Verbindung gebracht und wird häufig im Kontext der Stressanpassung von Tumorzellen sowie der Resistenz gegen proteotoxischen Stress untersucht.

Bag-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BAG3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Bag-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BAG3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BAG3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Bag-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BAG3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Bag-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Bag-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BAG3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.