AWAT2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404122-ACT

Humanes AWAT2 (Acyl-CoA-Wachsalkohol-Acyltransferase 2) ist eine mit dem endoplasmatischen Retikulum assoziierte Acyltransferase, die die Bildung von Wachsestern katalysiert, indem sie Fettsäureacylgruppen von Acyl-CoA auf Fettalkohole überträgt. Diese Aktivität verknüpft AWAT2 mit dem Stoffwechsel neutraler Lipide und überschneidet sich mit Signal- und Stoffwechselwegen, die die Aktivierung von Fettsäuren, die Biogenese von Lipidtröpfchen und die talgdrüsenassoziierte Lipidproduktion steuern. Expression und Funktion von AWAT2 werden häufig im Zusammenhang mit der Zusammensetzung der Hautbarriere, der Sebumhomöostase und gewebespezifischem Lipid-Remodeling untersucht. Eine fehlregulierte Wachsestersynthese und ein umfassenderes Ungleichgewicht im Lipidstoffwechsel sind für entzündliche Hautphänotypen und metabolische Stresszustände relevant und motivieren mechanistische Studien zum von AWAT2 getriebenen Lipidfluss in humanen Zellsystemen.

AWAT2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AWAT2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AWAT2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AWAT2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AWAT2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AWAT2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AWAT2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AWAT2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AWAT2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AWAT2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.