ATR CRISPR Activation Plasmid (m): sc-434115-ACT

Mouse Atr kodiert ATR, eine PI3K‑ähnliche Serin/Threonin‑Kinase, die bei Replikationsstress die DNA‑Schadensantwort koordiniert. ATR wird an RPA‑beschichteter einzelsträngiger DNA aktiviert und signalisiert über Effektoren wie CHK1, um gestoppte Replikationsgabeln zu stabilisieren, das Abfeuern von Replikationsursprüngen zu regulieren und die intra‑S‑ sowie G2/M‑Checkpoints durchzusetzen. Dieser Signalweg bewahrt die Genomintegrität, indem er DNA‑Reparatur fördert und den Zellzyklus kontrolliert; dabei überschneidet er sich mit Prozessen wie homologer Rekombination, Schutz der Replikationsgabel und Regulation der Apoptose. Eine fehlregulierte ATR‑Signalgebung ist mit Phänotypen genomischer Instabilität verknüpft und wird häufig im Kontext der Krebsbiologie sowie von Entwicklungsstörungen untersucht, die mit einer beeinträchtigten Kontrolle der DNA‑Schadenscheckpoints einhergehen.

ATR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Atr-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ATR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Atr-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Atr-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ATR-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Atr-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ATR-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ATR-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Atr-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.