Atg9b CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406894-ACT

Humanes ATG9B kodiert Atg9b, ein multipassierendes Transmembranprotein, das die Biogenese von Autophagosomen unterstützt, indem es die Membranlieferung zu den Orten der Autophagosomenbildung koordiniert. ATG9B wirkt in zentralen Makroautophagie‑Signalwegen und ist mit vesikulärem Transport, Organell‑Qualitätskontrolle und stressadaptiven Antworten verknüpft, die die Proteostase und den zellulären Stoffwechsel beeinflussen. Fehlregulierte Autophagie und Störungen im ATG‑Netzwerk wurden mit Tumorbiologie, Neurodegeneration und entzündlichen Prozessen in Zusammenhang gebracht, wodurch ATG9B ein nützlicher Knotenpunkt für mechanistische Untersuchungen des autophagischen Flusses und der Membrandynamik ist. Forschungsanwendungen umfassen das Kartieren von Signalweg‑Epistasen mit der ULK1–BECN1‑Signalgebung, das Untersuchen selektiver Autophagie‑Kontexte sowie das Verknüpfen der ATG9B‑Expression mit Phänotypen wie dem Überleben unter Nährstoffstress.

Atg9b Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATG9B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Atg9b Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATG9B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATG9B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Atg9b-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATG9B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Atg9b-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Atg9b-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATG9B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.