ASPP1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423473-ACT

Das murine Gen **Ppp1r13b** kodiert **ASPP1**, einen konservierten Regulator der p53-Familie, der sequenzspezifische Transkriptionsprogramme verstärkt, welche Apoptose, Zellzyklusarrest und DNA-Schadensantworten steuern. ASPP1 moduliert das Gleichgewicht zwischen pro-Überlebens- und pro-tödlichen Signalen, indem es die Auswahl der Zielgene von p53, p63 und p73 beeinflusst, und arbeitet mit stressresponsiven Signalwegen zusammen, die die Homöostase und Differenzierung von Epithelien prägen. Durch diese Funktionen ist eine veränderte ASPP1-Aktivität für experimentelle Modelle der Tumorsuppression, genomischen Instabilität und kontextabhängiger Umgestaltung von Zellschicksalsentscheidungen relevant. **Ppp1r13b** ist daher ein nützlicher Knotenpunkt, um Transkriptionskontrollmechanismen zu untersuchen, die die Erfassung zellulären Stresses mit dem programmierten Zelltod koppeln.

ASPP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ppp1r13b-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ASPP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ppp1r13b-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ppp1r13b-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ASPP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ppp1r13b-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ASPP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ASPP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ppp1r13b-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.