Plasmide CRISPR d'Activation (m) ASC/TMS1/PYCARD: sc-426209-ACT

Pycard code pour ASC (également appelé TMS1/PYCARD), une protéine adaptatrice bipartite contenant des domaines PYD et CARD, qui nucléise l’assemblage de l’inflammasome dans les cellules myéloïdes et épithéliales. ASC fait le lien entre des récepteurs de reconnaissance des motifs en amont, tels que NLRP3, AIM2 et NLRC4, et la pro-caspase-1, permettant l’activation de la caspase-1, la maturation de l’IL‑1β et de l’IL‑18, ainsi que l’exécution de la mort cellulaire pyroptotique. Dans des modèles murins, la signalisation dépendante de Pycard module les réponses immunitaires innées aux signaux de danger microbiens et stériles, en influençant les cascades de cytokines, le recrutement des leucocytes et les lésions tissulaires. Une activité dérégulée de l’inflammasome ASC a été impliquée dans des phénotypes inflammatoires et neuro-inflammatoires, l’inflammation métabolique et des modifications du microenvironnement immunitaire associé aux tumeurs, faisant de Pycard un nœud clé pour l’exploration des voies de signalisation.

ASC/TMS1/PYCARD Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Pycard sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ASC/TMS1/PYCARD Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Pycard dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Pycard, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ASC/TMS1/PYCARD. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Pycard natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ASC/TMS1/PYCARD au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ASC/TMS1/PYCARD dans les cellules tumorales présentant une expression de Pycard silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.