ARHGAP18 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-413983-ACT

ARHGAP18 kodiert ein Rho-GTPase-aktivierendes Protein, das die Signalübertragung der Rho-Familie herunterreguliert, indem es die GTP-Hydrolyse beschleunigt und so das Gleichgewicht zwischen aktiven und inaktiven Rho-GTPasen fein abstimmt. Durch die Modulation von Zytoskelett-Umbau, Zellform, Adhäsion und Migration trägt ARHGAP18 zu Prozessen wie der Regulation der Endothelbarriere und koordinierter Zellbeweglichkeit bei. Diese Funktionen verknüpfen ARHGAP18 mit Signalwegen, die die Aktin-Dynamik und die Organisation von Zellkontakten steuern, und machen das Gen für die Untersuchung der Gefäßbiologie sowie stressinduzierter Veränderungen des Zellverhaltens relevant. Eine fehlregulierte Rho-GTPase-Signalgebung und eine veränderte ARHGAP18-Aktivität oder -Expression wurden in experimentellen Systemen mit Phänotypen in Verbindung gebracht, die für Entzündung, abnorme Migration und krebsassoziierte Zellinvasion relevant sind.

ARHGAP18 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ARHGAP18-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ARHGAP18 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ARHGAP18-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ARHGAP18-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ARHGAP18-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ARHGAP18-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ARHGAP18-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ARHGAP18-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ARHGAP18-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.