Plásmido CRISPR de Activación (h) APPL1: sc-402243-ACT

APPL1 (proteína adaptadora, que interactúa con fosfotirosina mediante un dominio PH y una cremallera de leucina 1) es un adaptador endosomal citosólico que conecta el tráfico de membranas con la transducción de señales aguas abajo de receptores como los receptores de adiponectina y las vías de insulina/IGF. Al unirse a Rab5 y a fosfoinosítidos y al activar la señalización de AKT y AMPK, APPL1 modula la dinámica endosomal, la homeostasis de la glucosa y las respuestas celulares a señales metabólicas. La señalización dependiente de APPL1 influye en la proliferación, la supervivencia y las respuestas al estrés oxidativo a través de PI3K–AKT y redes relacionadas. La alteración de la expresión o la función de APPL1 se ha asociado con resistencia a la insulina y fenotipos de síndrome metabólico, y se estudia con frecuencia en contextos que conectan la endocitosis con la señalización oncogénica y cardiometabólica.

APPL1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de APPL1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

APPL1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus APPL1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional APPL1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de APPL1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo APPL1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de APPL1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía APPL1 en células tumorales con expresión de APPL1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.