Plásmido CRISPR de Activación (h) ANO2: sc-404198-ACT

El ANO2 humano (anoctamina 2/TMEM16B) codifica un canal de cloruro activado por calcio que regula la excitabilidad de la membrana y la homeostasis iónica en células eléctricamente excitables. La actividad de ANO2 acopla las señales intracelulares de Ca2+ al flujo de cloruro, modulando la despolarización evocada por estímulos, los pospotenciales y la adaptación de la señal, especialmente en contextos sensoriales y neuronales. Mediante estos procesos, ANO2 contribuye a redes de señalización dependientes de Ca2+ que influyen en la neurotransmisión, la transducción sensorial y las respuestas celulares dependientes de la actividad. La alteración de la conductancia de cloruro de la familia de las anoctaminas se ha relacionado con una excitabilidad desregulada y disfunción sensorial, lo que convierte a ANO2 en un objetivo relevante para estudios mecanísticos de la biología de canales y de la señalización acoplada a Ca2+.

ANO2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ANO2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ANO2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ANO2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ANO2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ANO2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ANO2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ANO2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ANO2 en células tumorales con expresión de ANO2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.