AMPKγ3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403280-ACT

PRKAG3 kodiert die regulatorische AMPKγ3-Untereinheit der AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK), eines zentralen Energiesensors, der den AMP/ADP:ATP-Status integriert, um metabolische Anpassungen zu koordinieren. Durch die Modulation der Aktivierung des AMPK-Komplexes und der Substratspezifität beeinflusst AMPKγ3 Signalwege, die die Glukoseaufnahme, den Glykogenstoffwechsel, die mitochondriale Funktion und die Lipidhomöostase steuern – unter anderem über nachgeschaltete Knotenpunkte wie mTORC1 und Autophagie-Regulatoren. Obwohl AMPKγ3 am besten in quergestreifter Muskulatur charakterisiert ist, ist eine veränderte AMPK-Signalgebung unter Beteiligung von PRKAG3 auch für zelluläre Stressantworten relevant, die mit Insulinsensitivität, metabolischem Remodeling und entzündungsassoziierten Signalwegen zusammenhängen. Eine dysregulierte Aktivität des AMPK-Signalwegs wird häufig in Kontexten wie Mechanismen metabolischer Erkrankungen und Nährstoffstress in Tumorzellen untersucht, wobei eine PRKAG3-abhängige Regulation bioenergetische Phänotypen prägen kann.

AMPKγ3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRKAG3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AMPKγ3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRKAG3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRKAG3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AMPKγ3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRKAG3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AMPKγ3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AMPKγ3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRKAG3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.