ALKBH3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406896-ACT

ALKBH3 (nota anche come ABH3) codifica una diossigenasi dipendente da Fe(II)/2-ossoglutarato che demetila gli acidi nucleici alchilati, incluse lesioni quali 1-metiladenina e 3-metilcitosina nel DNA e nell’RNA a singolo filamento. Invertendo il danno citotossico da alchilazione, ALKBH3 contribuisce al mantenimento del genoma, alla tolleranza allo stress replicativo e al metabolismo dell’RNA in condizioni genotossiche. La sua attività si interfaccia con le vie della risposta al danno del DNA e può influenzare programmi trascrizionali legati alla progressione del ciclo cellulare. Un’alterata espressione di ALKBH3 è stata riportata in molteplici contesti tumorali ed è oggetto di studio per la sua relazione con fenotipi di instabilità genomica e con la sensibilità cellulare allo stress alchilante in sistemi modello.

ALKBH3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ALKBH3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ALKBH3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ALKBH3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ALKBH3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ALKBH3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ALKBH3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ALKBH3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ALKBH3 nelle cellule tumorali con espressione di ALKBH3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.