ALKBH3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406896-ACT

ALKBH3 (auch als ABH3 bekannt) kodiert eine Fe(II)/2‑Oxoglutarat‑abhängige Dioxygenase, die alkylierte Nukleinsäuren demethyliert, darunter Läsionen wie 1‑Methyladenin und 3‑Methylcytosin in einzelsträngiger DNA und RNA. Durch die Rückgängigmachung zytotoxischer Alkylierungsschäden trägt ALKBH3 zur Aufrechterhaltung der Genomstabilität, zur Toleranz gegenüber Replikationsstress und zum RNA‑Stoffwechsel unter genotoxischen Bedingungen bei. Seine Aktivität ist mit Signalwegen der DNA‑Schadensantwort verknüpft und kann Transkriptionsprogramme beeinflussen, die mit der Zellzyklusprogression zusammenhängen. Eine veränderte ALKBH3‑Expression wurde in mehreren Tumorkontexten beschrieben und wird in Modellsystemen hinsichtlich ihres Zusammenhangs mit Phänotypen genomischer Instabilität und der zellulären Empfindlichkeit gegenüber alkylierendem Stress untersucht.

ALKBH3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ALKBH3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ALKBH3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ALKBH3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ALKBH3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ALKBH3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ALKBH3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ALKBH3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ALKBH3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ALKBH3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.